Metodo Sanger y ejercicio 23

En 1975, Frederick Sanger desarrolló el método de secuenciación de ADN conocido como método de Sanger. Dos años más tarde empleó esta técnica para secuenciar el genoma del bacteriófago Phi-X174, el primer organismo del que se secuenció totalmente su genoma. Realizó este trabajo manualmente, sin ayuda de ningún automatismo. Este trabajo fue base fundamental para proyectos tan ambiciosos como el Proyecto Genoma Humano, y por él se le concedió su segundo Premio Nobel en 1980, que compartió con Walter Gilbert.
El método de secuenciación por dideoxinucleótidos, mejor conocido como el método Sanger se basa en el proceso biológico de la relicación del DNA. El método de secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo de dideoxinucleótidos que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3', de manera que cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de DNA en crecimiento, esta cadena no puede continuar elongándose. Esto es así ya que la DNA polimerasa necesita un grupo terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo.
El método comienza una vez se aísla y se clona el DNA que se desea secuenciar. Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola hebra para la secuenciación. En la secuenciación se utiliza un cebador o “primer” que se encarga de suministrar el terminal 3’OH que necesita la DNA polimerasa para comenzar a elongar. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el DNA molde de hebra sencilla que se desea secuenciar, con DNA polimerasa, con el “primer” y con los cuatro nucleótidos trifosfatados.
A cada tubo se le añade una pequeña proporción de un dideoxinucleótido trifosfato; un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producen cadenas de DNA de distintas longitudes, terminando todas en el lugar en el que se incorporó el dideoxinucleótido correspondiente añadido al tubo. Los productos de las 4 reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro dideoxinucleótidos, son cargados en un gel y sometidos a electroforesis. Así, obtendremos un patrón de bandas en orden, del que deducir la secuencia del ADN introducido

 

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La hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm), la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía.
Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U; C≡G; G≡C; T=A o U=A
Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente. Por el contrario, debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos, una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión.
El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la disolución que contiene la molécula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno; por tanto, y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos, dicha energía se traduce en una mayor temperatura. El %GC no es igual para todas las especies, es más, el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN, según qué tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mitocondrial.
En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo Northern blot, para uniones ADN-ARN.

Procedimiento experimental

1. La hélice de doble cadena (ADN) se separa mediante un proceso físico (calor) o químico (con una base fuerte, como la sosa cáustica). Esto rompe los enlaces por puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN.
2. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.
3. Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples.
4. La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van emparejando por las zonas complementarias (más estables termodinámicamente) y se va formando una nueva molécula hibridada

La velocidad de hibridación es un indicativo de la similaridad genética entre las dos muestras. El porcentaje de similaridad genómica y la velocidad de hibridación es directamente proporcional.

Experimento de Avery y Griffith

El experimento de Griffith, llevado a cabo en 1928,  fue uno de los primeros experimentos que demostró que las bacterias  eran capaces de transferir información genética mediante un proceso llamado transfomación
En 1928 , el microbiólogo Frederick Griffith, que investigaba varias cepas de neumococo (Streptococcus pneumoniae), inyectó en ratones la cepa S y la cepa R de la bacteria. La cepa S era dañina, mientras que la rugosa (R), no lo era ya que la cepa S se cubre a si misma con una cápsula de polisacaraido  que la protege del sistema inmune del ser que ha sido infectado, resultando en la muerte de este, mientras que la cepa R no contiene esa cápsula protectora es derrotada por el sistema inmunitario . Cuando, inactiva por calor, la cepa S era inyectada, no había secuelas y el ratón vivía. Sorprendentemente, al combinar cepa R (no letal), con cepa S inactivada por calor (no letal), el ratón murió. Además, Griffith encontró células de cepa S vivas. En apariencia la cepa R se convirtió en cepa S. Este hallazgo no se pudo explicar, hasta que en 1944 Avery , MacLeod, y McCarty, cultivaron cepa S y:

1. Produjeron extracto de lisado de células (extracto libre de células).
2. Tras eliminar los lípidos, proteínas y polisacáridos, el estreptococo aún conservó su capacidad de replicar su ADN e introducirlo en neumococo R.

La inactivación por calor de Griffith habría dejado intacto el ADN de los cromosomas de las bacterias, que era el causante de la formación del gen  S, y podía ser liberado por las células destruidas e implantarse en cultivos sucesivos de cepa R.

¿En qué consistió su experimento?

El 20 de julio de 1890 Frederick Griffith, investigando una enfermedad infecciosa mortal, la neumonía, estudió las diferencias entre una cepa de la bacteria Streptococcus pneumoniae que producía la enfermedad y otra que no la causaba. La cepa que causaba la enfermedad estaba rodeada de una cápsula (también se la conoce como cepa S, del inglés smooth, o sea lisa, que es el aspecto de la colonia en las placas de Petri). La otra cepa (la R, de rugosa, que es el aspecto de la colonia en la placa de Petri) no tiene cápsula y no causa neumonía. Griffith inyectó las diferentes cepas de la bacteria en ratones. La cepa S mataba a los ratones mientras que la cepa R no lo hacía. Luego comprobó que la cepa S, muerta por calentamiento, no causaba neumonía cuando se la inyectaba. Sin embargo cuando combinaba la cepa S muerta por calentamiento, con la cepa R viva, es decir con componentes individuales que no mata a los ratones e inyectaba la mezcla a los ratones, los ratones contraían la neumonía y morían; en la sangre de estos ratones muertos Griffith encontró neumococos vivos de la cepa S. Es decir que en las bacterias S muertas había “algo” capaz de transformar a las bacterias R, antes inocuas, en patógenas y este cambio era permanente y heredable. Este "algo" fue aislado; luego se encontró que era   ADN . Las bacterias que se taislaban de los ratones muertos poseían cápsula y, cuando se las inyectaba, mataban otros ratones. Frederick Griffith fue capaz de inducir la transformación de una cepa no patógena Streptococcus pneumoniae en patógena. Griffith postuló la existencia de un factor de transformación como responsable de este fenómeno.

El problema que quería investigar con su experimento

Frederick Griffith estaba interesado en la virulencia  (capacidad de infectar y producir enfermedad) de las bacterias causantes de la neumonía, llamadas Streptococcus pneumoniae. Este experimento marca el inicio de la investigación hacia el descubrimiento del ADN como material genético.

Mas informacion : http://es.wikipedia.org/wiki/Experimento_de_Griffith